酶聯免疫吸附實驗實驗操作（二）

1：再每個EP管中加入150ul標準品稀釋液，更換槍頭后在1號管中加入150ul標準品。更換槍頭并將EP管用混勻儀混勻5秒

2：在1號管中吸取150ul加入2號管中，更換槍頭并將EP管用混勻儀混勻5秒。在2管中吸取150ul加入到3號管中，以此類推

3：【加樣】：移液器調至50ul，標準品每個濃度點2個孔，每孔加入50ul。（加樣過程中注意更換槍頭)多道移液器調至40ul，樣本孔中每孔加入40ul樣本稀釋液；更換10ul移液器和槍頭，樣本孔中每孔加入10ul樣本（空白孔中不加入任何液體）（上海軒澤康生物溫馨提示：加樣時間盡量控制在15分鐘之內完成，避免造成前后孔反應時差。）

4：【孵育及洗滌）：封上封板膜并輕輕搖晃酶標板，標記項目及時間后置入37℃恒溫箱中孵育30分鐘。孵育結束后取出酶標板。

5：【洗滌】：將洗滌液倒入容器中，小心揭掉封板膜。棄去液體并在吸水紙上拍干。準備200ul多道移液器，每孔加200ul洗滌液，靜置30秒后棄去液體。重復洗滌、靜置、棄液步驟5次并拍干酶標板。

6：【加酶】：每孔加入酶標試劑50ul（空白孔除外），封上封板膜并輕輕搖晃酶標板，標記項目及時間后置入37℃恒溫箱中孵育30分鐘，孵育結束后取出酶標板。小心揭掉封板膜，棄去液體。

7：【洗滌】：每孔加200ul洗滌液，靜置30秒后棄去。重復洗滌、靜置、棄液步驟5次。在吸水紙上拍干剩余液體。

8：【顯色】：將底物A、B分別倒入容器中.每孔加入50ul底物A,更換槍頭后每孔加入50ul底物B。封上封板膜并輕輕搖晃酶標板，標記項目及時間后置入37℃恒溫箱中避光孵育10分鐘.孵育結束后取出酶標板。小心揭掉封板膜。

此時酶標板應有成梯度的可見色差

9：【終止】：終止液倒入容器中，每孔加終止液50ul進行終止反應。此時酶標板內液體由藍色轉變為黃色，輕輕搖晃酶標板后待用。

10：【測定讀數】：酶標板放入酶標儀進行檢測，以空白孔調零450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）

測定應在加終止液后15分鐘以內進行。